生物竞赛心得体会高中生及感悟 学生生物心得体会(5篇)

我们得到了一些心得体会以后，应该马上记录下来，写一篇心得体会，这样能够给人努力向前的动力。大家想知道怎么样才能写得一篇好的心得体会吗？以下我给大家整理了一些优质的心得体会范文，希望对大家能够有所帮助。

主题生物竞赛心得体会高中生及感悟一

乙方(供方)：(以下简称乙方)

为了共同发展，规范甲、乙双方的业务合作关系，经双方共同协商，本着“平等发展、互惠互利”的原则，就有关生物质成型燃料的保证供给事宜，根据《中华人民共和国民法典》订立本合同，并严格遵守履行。

协议如下：

一、合作条件

1、甲方确定乙方为其生物质燃料指定供应商，并按照合同约定的时间和双方确定的付款标准及时付款。

2、乙方提供的生物质燃料必须满足甲方设备的使用要求和质量要求，能及时送货并保证不出现断料的情况，确保不影响甲方的正常生产运营。

不可抗拒因素导致的断料除外(如：原料购买不到，连降暴雨导致原料湿度太大)

二、供货方式及保证

1、甲方根据锅炉消耗情况确定生物质燃料需求量，及时联系乙方提供生物质燃料;乙方必须保证及时送货，并保证甲方有一定的库存。

2、乙方应将生物质燃料发货至甲方指定仓库或地点，乙方负责卸货，同时提供送货数量确认单，作为备案依据。

三、价格确定与结算方式

1、根据锅炉项目的特点，甲乙双方友好协商后确定：双方以锅炉的实际输出蒸汽量为结算依据，结算价格为：185元/吨汽，此价格不受生物质燃料价格影响。

乙方只负责足额供应合格品质的生物质燃料。

2、锅炉蒸汽计量以第三方提供的、具有资质的单位标定的蒸汽流量计记录为准，蒸汽计量点设在锅炉主蒸汽管上。

3、甲方在与第三方企业针对蒸汽用能结算时，将支付乙方的货款以委托形式由第三方企业直接支付给乙方。

四、质量要求乙方向甲方提供的产品应符合甲方项目使用标准要求。

经双方一致确认，本合同约定之产品应达到的质量标准为：

1、热值：生物质燃料发热量不低于3500kcal/kg。

2、纯度：生物质燃料，主体为花生壳或纯木质原料，不含任何粘合剂及添加剂，含水率(%)15;密度(kg/m3)0.9;灰分(%)﹤6.5。

燃料中禁止混入煤矸石、石头、砖块、泥沙、钢筋头、电焊头等硬物件。

3、若由于乙方产品质量问题，如热值低等，造成甲方生产蒸汽使用压力不足，不能达到第三方企业用汽要求的，由此带来的直接或间接经济损失乙方负责赔偿。

若甲方由于技术或管理方面造成的蒸汽压力不足，乙方不负任何责任。

4、乙方供应生物质燃料中杂质大或混入硬物造成供热设备损坏的，由乙方承担向甲方的赔偿责任。

五、其它约定

1、基于本项目的其它可能收入，如：政府层面的节能补贴、生物质成型燃料示范项目补贴等，在项目补贴到账后，扣除项目的申报费用后，甲乙双方以5﹕5分享。

2、乙方应向甲方提供相应的生物质燃料税票，以完成或满足项目其它方面的申报手续。

六、违约责任

1、乙方应自主完成生物质燃料的制造、质量把关、运输、入库等工作;乙方向甲方所供产品因制造、质量、运输、入库(如：送货车辆撞坏第三方企业消防设施等)等原因，造成第三方企业直接、间接损失或事故由乙方承担相应的完全责任，属于损害甲方利益的，应向甲方负赔偿责任。

2、因第三方企业拖延付款时，有超出最迟约定付款期限的，甲乙双方有共同向第三方企业追收货款的权力，甲乙双方不互为承担拖延支付之责任。

七、争议的解决在履行本合同过程中，如发生争议，则双方协商解决;如协商不成，双方均同意在甲方所在地人民法院采取诉讼方式解决。

八、合同期、生效及其它

1、本合同期自年月日至年月日。

合同期年。

2、本合同经双方授权代表签字盖章后生效。

3、本合同条款的任何变更、修改或增减，须经双方协商后授权代表签署书面文件，作为本协议的组成部分并具有同等法律效力。

4、本合同中任何未尽适宜，双方将以友好方式解决。

5、本合同一式二份，甲乙双方各执一份，每份具有同等法律效力。

甲方盖章乙方盖章

授权代表：授权代表：

地址：地址：

电话：电话：

传真：传真：

签约时间：年月日

主题生物竞赛心得体会高中生及感悟二

1．实验前应认真预习实验指导，明确实验目的和要求，写出预实验报告。

2．进入实验室必须穿白大衣。严格遵守实验课纪律，不得无故迟到或早退。不得高声说话。严禁拿实验器具开玩笑。实验室内禁止吸烟、用餐。

3．严格按操作规程进行实验。实验过程中自己不能解决或决定的问题，切勿盲目处理，应及时请教指导老师。

4．严格按操作规程使用仪器，凡不熟悉操作方法的仪器不得随意动用，对贵重的精密仪器必须先熟知使用方法，才能开始使用；仪器发生故障，应立即关闭电源并报告老师，不得擅自拆修。

5．取用试剂时必须“随开随盖”，“盖随瓶走”，即用毕立即盖好放回原处，切忌“张冠李戴”，避免污染。

6．爱护公物，节约水、电、试剂，遵守损坏仪器报告、登记、赔偿制度。

7．注意水、电、试剂的使用安全。使用易燃易爆物品时应远离火源。用试管加热时，管口不准对人。严防强酸强碱及有毒物质吸入口内或溅到别人身上。任何时候不得将强酸、强碱、高温、有毒物质抛洒在实验台上。

8．废纸及其它固体废物严禁倒入水槽，应倒到垃圾桶内。废弃液体如为强酸强碱，必须事先用水稀释，方可倒入水槽内，并放水冲走。

9．以实事求是的科学态度如实记录实验结果，仔细分析，做出客观结论。

实验失败，须认真查找原因，而不能任意涂改实验结果。实验完毕，认真书写实验报告，按时上交。

10．实验完毕，个人应将试剂、仪器器材摆放整齐，用过的玻璃器皿应刷洗干净归置好，方可离开实验室。值日生则要认真负责整个实验室的清洁和整理，保持实验整洁卫生。离开实验室前检查电源、水源和门窗的安全等，并严格执行值日生登记制度。

实验报告通过分析总结实验的结果和问题，加深对有关理论和技术的理解与掌握，提高分析、综合、概括问题的能力，同时也是学习撰写研究论文的过程。

1．实验报告应该在专用的生化实验报告本上、按上述格式要求书写。

2．实验报告的前三部分①实验原理、②实验材料（包括实验样品、主要试剂、主要仪器与器材）、③实验步骤（包括实验流程与操作步骤）要求在实验课前预习后撰写，作为实验预习报告的内容。预习时也要考虑并设计好相应实验记录的表格。

3．每项内容的基本要求

（1）实验原理：简明扼要地写出实验的原理，涉及化学反应时用化学反应方程式表示。

（2）实验材料：应包括各种来源的生物样品及试剂和主要仪器。说明化学试剂时要避免使用未被普遍接受的商品名和俗名。试剂要标清所用的浓度。

（3）实验步骤：描述要简洁，不能照抄实验讲义，可以采用工艺流程图的方式或自行设计的表格来表示，但对实验条件和操作的关键环节应写清楚，以便他人重复。

（4）实验记录：包括主要实验条件、实验中观察到的现象及实验中的原始数据。

（5）结果（定量实验包括计算）：应把所得的实验结果（如观察现象）和数据进行整理、归纳、分析、对比，尽量用图表的形式概括实验的结果，如实验组与对照组实验结果的比较表等(有时对实验结果还可附以必要的说明)。

（6）讨论：不应是实验结果的重述，而是以结果为基础的逻辑推论。如对定性实验，在分析实验结果的基础上应有中肯的结论。还可以包括关于实验方法、操作技术和有关实验的一些问题，对实验异常结果的分析和评论，对于实验设计的认识、体会和建议，对实验课的改进意见等。

（7）结论：一般实验要有结论，结论要简单扼要，说明本次实验所获得的结果。

1．实验预习报告内容（30分）

学生进入实验室前应预习实验，并书写预习报告。实验预习报告应包括以下三部分： ①实验原理（10分）：要求以自己的语言归纳要点；②实验材料（5分）：包括样品、试剂及仪器。只列出主要仪器、试剂（常规材料不列）；③实验方法（15分）：包括流程或路线、操作步骤，要以流程图、表格式给出要点，简明扼要。依据各部分内容是否完整、清楚、简明等，分以下三个等级给分。

优秀：项目完整，能反映实验者的加工、整理、提炼。

合格：较完整，有一定整理，但不够精炼。

不合格：不完整、缺项，大段文字，完全照抄教材，记流水账。

实验预习报告不合格者，不允许进行实验。该实验应重新预约，待实验室安排时间后方可进行实验。

2．实验记录内容（20分）

实验记录是实验教学、科学研究的重要环节之一，必须培养严谨的科学作风。

实验记录的主要内容包括以下三方面：①主要实验条件（如材料的来源、质量；试剂的规格、用量、浓度；实验时间、操作要点中的技巧、失误等，以便总结实验时进行核对和作为查找成败原因的参考依据）；②实验中观察到的现象（如加入试剂后溶液颜色的变化）；③原始实验数据：设计实验数据表格（注意三线表格式），准确记录实验中测得的原始数据。记录测量值时，要根据仪器的精确度准确记录有效数字（如吸光值为0.050，不应写成0.05），注意有效数字的位数。

实验记录应在实验过程中书写；应该用钢笔或者圆珠笔记录，不能用铅笔。记录不可擦抹和涂改，写错时可以准确划去重记。记录数据时请教师审核并签名。

实验记录分以下三个等级给分。

优秀：如实详细地记录了实验条件、实验中观察到的现象、结果及实验中的原始数据（如三次测定的吸光度值）等；实验记录用钢笔或者圆珠笔记录，没有抹擦和涂改迹象。书写准确，表格规范（三线表）。有教师的签字审核。

合格：记录了主要实验条件，但不详细、凌乱；实验中观察到的现象不细致；原始数据无涂改迹象，但不规范。有教师的签字审核。

不合格：记录不完整，有遗漏；原始数据有抹擦和涂改迹象、捏造数据（以0分计）；图、表格形式错误；用铅笔记录原始数据；无教师的签字审核。 若记录的结果有怀疑、遗漏、丢失，必须重做实验，培养严谨的科学作风。

3．结果与讨论（45分）

（1）数据处理（5分）

对实验中所测得的一系列数值，要选择合适的处理方法进行整理和分析。数据处理时，要根据计算公式正确书写中间计算过程或推导过程及结果，得出最终实验结果。要注意有效数字的位数、单位（国际单位制）。经过统计处理的数据要以x〒sd表示。可分成以下三个等级给分。

优秀：处理方法合理，中间过程清楚，数据格式单位规范。

合格：处理方法较合理，有中间计算过程；数据格式单位较规范。

不合格：处理方法不当；无中间过程；有效数字的位数、单位不规范。

（2）结果（20分）

实验结果部分应把所观察到的现象和处理的最终数据进行归纳、分析、比对，以列表法或作图法来表示。同时对结果还可附以必要的说明。

要注意图表的规范：表格要有编号、标题；表格中数据要有单位（通常列在每一列顶端的第一行或每一行左端的第一列）。图也要有编号、标题，标注在图的下方；直角坐标图的纵轴和横轴要标出方向、名称、单位和长度单位；电泳图谱和层析图谱等要标明正、负极方向及分离出的区带、色带或色斑的组分或成分。电泳结果还要标记泳道，并在图题下给出泳道的注释；要标出分子量标准的各条带的大小。并且注意需要结合图表对结果进行较详细的解释说明。

可分成以下三个等级给分。

优秀：实验结果有归纳、 解释说明，结果准确，格式规范。

合格：堆砌实验现象、数据，解释说明少。

不合格：最终实验结果错误且无解释说明，图表、数字不规范。

（3）讨论（20分）

讨论应围绕实验结果进行，不是实验结果的重述，而是以实验结果为基础的逻辑推论，基本内容包括：①用已有的专业知识理论对实验结果进行讨论，从理论上对实验结果的各种资料、数据、现象等进行综合分析、解释，说明实验结果，重点阐述实验中出现的一般规律与特殊性规律之间的关系。

主题生物竞赛心得体会高中生及感悟三

1．还原糖的鉴定原理

生物组织中普遍存在的还原糖种类较多，常见的有葡萄糖、果糖、麦芽糖。它们的分子内都含有还原性基团（游离醛基或游离酮基），因此叫做还原糖。蔗糖的分子内没有游离的半缩醛羟基，因此叫做非还原性糖，不具有还原性。本实验中，用斐林试剂只能检验生物组织中还原糖存在与否，而不能鉴定非还原性糖。斐林试剂由质量浓度为0.1g／ml的氢氧化钠溶液和质量浓度为0.05g／ml的硫酸铜溶液配制而成，二者混合后，立即生成淡蓝色的cu(oh)2沉淀。cu(oh)2与加入的葡萄糖在加热的条件下，能够生成砖红色的cu2o沉淀，而葡萄糖本身则氧化成葡萄糖酸。其反应式如下：ch2oh—(choh)4—cho＋2cu(oh)2→ch2oh—(choh)4—cooh＋cu2o↓＋2h2o用斐林试剂鉴定还原糖时，溶液的颜色变化过程为：浅蓝色 棕色 砖红色(沉淀)。

2．蛋白质的鉴定原理

鉴定生物组织中是否含有蛋白质时，常用双缩脲法，使用的是双缩脲试剂。双缩脲试剂的成分是质量浓度为0.1g／ml的氢氧化钠溶液(a)和质量浓度为0.01g／ml(b)的硫酸铜溶液。在碱性溶液(naoh)中，双缩脲(h2noc—nh—conh2)能与cu2 作用，形成紫色或紫红色的络合物，这个反应叫做双缩脲反应。由于蛋白质分子中含有很多与双缩脲结构相似的肽键，因此，蛋白质可与双缩脲试剂发生颜色反应。

3．脂肪的鉴定原理

脂肪可以被苏丹ⅲ染成橘黄色，被苏丹ⅳ染成红色

关于鉴定还原糖的实验，在加热试管中的溶液时，应该用试管夹夹住试管上部，并放入盛开水的大烧杯中加热。注意试管底部不要接触烧杯底部，同时试管口不要朝向实验者，以免试管内溶液沸腾时冲出试管，造成烫伤。如果试管内溶液过于沸腾，可以上提试管夹，使试管底部离开大烧杯中的开水。

2.斐林试剂的甲液和乙液混合均匀后方可使用，切勿将甲液和乙液分别加入组织样液中。

3．蛋白质的鉴定中先加双缩脲a，再加双缩脲b六、讨论鉴定生物组织中还原糖、脂肪、蛋白质的根据是什么？

主题生物竞赛心得体会高中生及感悟四

本学期为高三第一学期，总结以往高三生物教学得失，针对浙江高考新政策，制定本教学计划。

新高考，虽然给我们教学带来很多困惑，但或许其中蕴藏着很大机遇，机遇是为有准备人准备，所以我们要充分做好准备，抓住机遇。校重点班学生基础薄弱，针对这一现状如何抓住高三这一关健学年，使各个学生都能得到进步，在现有基础上有一个更大提高。需制定周密且可行教学计划，抓住每一个细节，抓实每一个过程。

抓全体就是不放弃每一个学生，抓重点就是心中有重点工作对象。因为罗中学生文化基础薄弱，人人希望上本科是不切实际，为此教学中我们时刻必须做到心中有重点，关注重点学生每一道作业，每一次训练，每一次考试。对学习成绩不太理想学生给予双倍呵护关心，关心他们学习生活心理，给予他们学习鼓励心理疏导，生活帮助。在教学过程中以民主诚恳态度对待学生；善于以适合方法引导学生，注意从学生角度来思考问题，容易接受学生合理建议，相信学生能力，尊重学生思想感情。

备课是提高课堂教学效率根本途径。首先，加强集体备课，将其落到实处，而不是流于形式。备课组成员就每一节课教学内容本节知识中重点难点疑点重点难点教学方法教学精选选择用什么方式呈现给学生加强合作研究，在教学中不断反思，不断改进。其次强调每个老师就每一课内容备个案，各抒己见，百花齐放，而且就各个班学生不同特点，备教法学法。

试题设计上讲究适量适合测试目标，以夯实基础为主要目标。同时重视对学生比较，图表分析实验等答题能力培养。

练习批改上讲究细致实效，学生每一份练习都是学生辛勤劳动成果，也是学生学习情况真实反馈，我认为无论如何都得重视学生每一次练习，做到精改精批，在训练基础上做到快反馈，快反馈不仅使我对训练中每一个问题或集体或个别能进行矫正或强化；还能根据反馈信息，时调整教学策略手段教学进度；能把学生取得进步变成有形事实，使之受到激励，乐于接受下一次学习，使学生生物学习进入良性循环轨道。

新高考，新教材。而教材是我们学习根本。因而，高考要取得好成绩，平时吃透课本就显得相当重要必要。那么，如何吃透课本呢?其一是将课本读“薄”，删减高考不可能考或极小可能考内容，减轻学生负担，提高备考效度。

在教学过程中我根据教学需要打乱课本原有章节结构，设置具有一定思维性可操作性，又能起阶段小结作用问题，调动学生思维，拓展学生视野。每一单元围绕单元知识重点难点知识结构构建单元知识网络，进行单元检测且时反馈，了解学生疑难改进教学策略。针对我校学生基础不扎实实际情况，在第一轮单元复习时基本课本顺序为主线条，从落实基础知识开始，提高学生基本技能，逐渐提高学生学习能力，从而提高复习课质量。

担任高三8三9三10生物教学，三个班都是校重点班，班主任分别是陈献娟金玲玲潘晓鸥。

新课20xx年暑期到第一学期期中考试选修3选修2

第一轮第一学期期中考试到第二学期第二周

内容章节复习每周练习

20xx年一摸考试强化练习专门纠错

第二轮20xx年第二学期第二周到二模

内容主题复习尖子生强化临界辅导

第三轮20xx年5月中旬到考前

内容查缺补漏高考适应性练习

使用老师推荐书籍，另外自己可以一本自学书籍

课堂练习，老师布置，概念题或问答题。当堂或当天完成，

有收缴有批改抽查普查结合。

每周一练，有收缴有批改

每月一考，年级统测有收缴有批改

主题生物竞赛心得体会高中生及感悟五

质粒dna的提取、纯化及检测

姓名：xxx学号：2011001400xx年级：20xx级生物基地班 实验日期：20xx年9月16日—30日组别：6组 同组者：xx

1、掌握碱变性提取法提取大肠杆菌中质粒dna的原理和方法。

2、学习并掌握凝胶电泳进行dna的分离纯化的实验原理。

3、学习并掌握凝胶的制备及电泳方法。

4、学习并掌握凝胶中dna的分离纯化方法。

1、质粒dna的制备方法

质粒（plasmid）是独立存在于染色体外、能自主复制并能稳定遗传的一种环状双链dna分子，分布于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，但在细菌细胞中含量最多。细菌质粒大小介于1～200kb之间，是应用最多的质粒类群，在细菌细胞内它们利用宿主细胞的复制机构合成质粒自身的dna。

质粒dna的制备包括3个步骤：①培养细菌，使质粒dna大量扩增；②收集和裂解细菌；③分离和纯化质粒dna。主要方法包括：碱裂解法：0。2molnaoh 1%sds；煮沸裂解法：沸水煮沸40秒；sds裂解法：10%sds，一般用于质粒大量提取。在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒dna的用途进行选择。本实验选择碱裂解法提取质粒dna。

2、质粒dna的提取——碱变性提取法

在细菌细胞中，染色体dna和质粒dna均被释放出来，但是两者变性与复性所依赖的溶ph值不同。在ph值高达12。0的碱性溶液中，染色体dna的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒dna的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。因为它们在拓扑学上是相互缠绕的。当用ph值4。6的kac（naac）高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒dna可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体dna不能复性，而是与不稳定的大分子rna、蛋白质—sds复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒dna分离。溶于上清液的质粒dna，可用无水乙醇和盐溶液，使之凝聚而形成沉淀。由于dna和rna性质类似，乙醇沉淀

dna的同时，也伴随着rna沉淀，可利用rnasea将rna降解。质粒dna溶液中的rnasea以及一些可溶性蛋白，可通过酚/氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒dna。

3、凝胶电泳进行dna分离纯化

电泳（electrophoresis）是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极方向移动的现象。各种生物大分子在一定ph条件下，可以解离成带电荷的离子，在电场中会向相反的电极移动。凝胶是支持电泳介质，它具有分子筛效应。含有电解液的凝胶在电场中，其中的电离子会发生移动，移动的速度可因电离子的大小形态及电荷量的不同而有差异。利用移动速度差异，就可以区别各种大小不同的分子。因而，凝胶电泳可用于分离、鉴定和纯化dna的片段，是分子生物学的核心技术之一。

凝胶电泳技术操作简单而迅速，分辨率高，分辨范围广。此外，凝胶中dna的位置可以用低浓度荧光插入染料如溴化乙锭（ethidium bromide，eb）或sybr gold染色直接观察到，甚至含量少至20pg的双链dna在紫外激发下也能直接检测到。需要的话，这些分离的dna条带可以从凝胶中回收，用于各种各样目的的实验。

分子生物学中，常用的两种凝胶为琼脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺凝胶。这两种凝胶能灌制成各种形状、大小和孔径，也能以许多不同的构型和方位进行电泳。聚丙烯酰胺凝胶分辨率高，使用于较小分子核酸（5—500bp）的分离和蛋白质电泳。它的分辨率非常高，长度上相差1bp或质量上相差0。1%的dna都可以彼此分离，这也是采用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行dna序列分析的分子基础。虽然它能很快地进行电泳，并能容纳较大的dna上样量，但是与琼脂糖凝胶相比，在制备和操作上繁琐。琼脂糖是从海藻中提取的长链状多聚物，由β—d—吡喃半乳糖与3，6—脱水—l—吡喃半乳糖组成，相对分子质量为104—105。琼脂糖加热至90℃左右，即可溶化形成清亮、透明的液体，浇在模版上冷却后形成凝胶，其凝固点为40—45℃。琼脂糖凝胶相对于聚丙烯酰胺凝胶分辨率低，但它的分离范围更大（50至百万bp），小片段dna（50—20000bp）最适合在恒定轻度和方向的电场中水平方向的琼脂糖凝胶内电泳分离。琼脂糖凝胶电泳易于操作，适用于核酸电泳，测定dna的相对分子质量，分离经限制酶水解的dna的片段，进一步纯化dna等。

琼脂糖凝胶电泳是一种常用的方法。在溶液中，由于核酸有磷酸基而带有负电荷，在电场中向正极移动。dna在琼脂糖凝胶中的电泳迁移率主要取决于6个因素：样品dna分子的大小、dna分子的构象、琼脂糖浓度、电泳所用电场、缓冲液和温度。

1、实验仪器

培养皿、接种环、三角瓶、酒精灯、恒温振荡培养箱、50ml离心管、1。5ml塑料离心管（eppendorf管）、高速离心机、漩涡振荡器、微量移液器、不同型号枪头、天平、制胶槽、梳子、电泳仪、吸管、量筒、微波炉、灭菌锅、恒温水浴锅、试剂瓶、卫生纸和记号笔、手套等。

2、实验试剂

lb培养基，抗生素ap（氨苄青霉素），溶液ⅰ，溶液ⅱ，溶液ⅲ，rnasea母液，te缓冲液，饱和酚，氯仿/异戊醇混合液，酚/氯仿/异戊醇（pci）混合液，预冷无水乙醇，tae电泳缓冲液（10×），上样缓冲液（6×），琼脂糖，溴化乙锭（eb），dna相对分子质量标准物dna marker λ/hind ⅲ，5mol/l ph 5。2的醋酸钠。

1、准备实验

配制lb液体培养基，分装到100ml的三角瓶中20ml，300ml的三角瓶中50ml，另配lb固体培养基；准备1000ul、200ul、10ul移液枪尖各一盒，1。5ml离心管若干于500ml三角瓶中，50ml离心管2个 ，将上述物品包好连同配好的培养基一同灭菌。

2、菌体培养

在含有ap的lb平板上挑取一环携带有质粒puc19的e。coli dh5单菌落，接种于20mllb液体培养基中进行37℃振荡过夜培养，培养基中加ap100ul

（100ug/ml），质粒puc19具有ap抗性基因，使得带有puc19的质粒得以生长。 过夜培养后菌体量大，杂质较多，然后用移液枪吸取过夜培养物2ml转接于50mllb液体培养基中，培养基中加入ap250ul，37℃振荡培养4—6h至对数生长期后期，生长速率快，代谢旺盛，酶系活跃，杂质少，适合提取质粒。

3、质粒提取

（1）称量空的50ml离心管的重量为14。331g，然后将三角瓶中的菌液倒至管中，不能倒满，液面距管口约1cm，7000rpm离心5分钟后弃去上清液，收集菌体细胞。

（2）向离心管中悬滴加入5ml冰预冷的溶液ⅰ打散菌体洗涤，用漩涡振荡器使之充分悬浮后用枪尖吹吸混匀，同步骤（1）离心，弃去上清，将离心管倒置于吸水纸上，使上清液全部流尽干燥，然后称重得14。437g，则菌体质量为106mg。

（3）洗涤后每100mg菌体应加入冰预冷的溶液ⅰ1ml，106mg菌体按100mg菌体处理，加入溶液ⅰ1ml，打散菌泥、吹吸混匀，冰浴5min。溶液ⅰ中的葡萄糖使

溶液密度增加，悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；维持渗透压，防止细胞提前破裂，防止dna受机械剪切力作用而降解。edta是ca2 和mg2 等二价金属离子的螯合剂，可抑制dnase的活性，抑制微生物的生长。tris—cl溶液提供适当的ph。

（4） 按比例加入新配制的溶液ⅱ2ml（与溶液ⅰ对应），轻加轻摇，冰浴5min。溶液变清亮透明粘稠如蛋清状。溶液ⅱ中的naoh使细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化导致细胞溶解。同时，强碱性使染色体dna、质粒dna和蛋白质变性；sds为下一步沉淀做铺垫。

（5）按比例加入冰预冷的溶液ⅲ1。5ml（与溶液ⅰ、ⅱ对应），轻加轻摇，冰浴10min。溶液出现白色絮状沉淀。沉淀为蛋白质sds复合物、细胞碎片和其他大分子成分。溶液ⅲ中的hac中和naoh，因为长时间的碱性条件会打断基因组dna，只要是50－100 kb大小的片断，就不能再被pds共沉淀。同时变性的质粒dna复性。反应形成的高盐环境进一步加速了沉淀。

（6）12000rpm离心15min，白色沉淀聚集在离心管一侧，用移液枪将上清液转移到另一洁净的离心管中。然后向上清液中加入1/10体积的3mnaac混匀，加入2倍体积的冰无水乙醇，混匀，—20℃下沉降30分钟。乙醇可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对dna很安全，因此是理想的沉淀剂。 dna溶液是dna以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去dna周围的水分子，使dna失水而易于聚合。在ph为8左右的溶液中，dna分子是带负电荷的，加一定浓度的naac或nacl，易于互相聚合而形成dna钠盐沉淀。

（7） 以12000rpm离心15min，小心倒去上清液，得到dna沉淀。加入3ml70%冰乙醇，轻轻地覆盖沉淀，不打散沉淀，洗涤一次。

（8）以12000rpm离心5min，离心管底部dna沉淀所在面应与收集沉淀面一致。去掉上清液，将离心管上沉淀部位做好标记，将离心管倒置于吸水纸上，干燥5min。粗提取的质粒呈浅黄色，随着水分的减少质粒变为无色。所以为了完全溶解质粒，要在离心管上标记质粒所在位置。

（9）将dna沉淀溶于1mlte缓冲液中，移液枪吹吸助溶，然后将溶解液转移到一个eppendorf管中。te是ph缓冲液，为dna提供稳定的生理状态，呈弱碱性，有利于保护碱基对。同时含有edta是二价阳离子的螯合剂，抑制dna酶作用。

4、质粒纯化

（1）eppendorf管中加入rnase a（纯浓度＞50ug/ml），37℃保温0。5—1h

（2）将上述的溶液平均分配到2个1。5ml的微量离心管中，每管0。5ml，分别加入与溶液等体积的（500ul）tris饱和苯酚溶液，振荡混匀，7000rpm，离心5min，上清液转移到一洁净的eppendorf管中。苯酚是经tris饱和后的，显黄色。苯

酚加入后，溶液分层，苯酚向下，下层呈浅黄色，上层溶液无色，在中间产生大量白色沉淀，此为变性后的蛋白质。

（3）加入等体积的（500ul）苯酚/氯仿溶液（1：1），振荡混匀， 7000rpm，离心5min，上清液转移到到另一洁净的eppendorf管中。苯酚是强的蛋白变性剂，但是苯酚留在质粒溶液中会影响dna的酶切，它本身易被氧化，会损伤质粒。氯仿也是蛋白变性剂，但是比酚弱，且能溶解质粒中的脂类，溶解苯酚，去除溶液中的苯酚。异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫，有利于分层更明显。此时溶液中已看不到明显的白色沉淀，但仍有蛋白质的存在。

（4）加入等体积的氯仿溶液，振荡混匀， 7000rpm，离心5min，上清液转移到一洁净的eppendorf管中，得上清液400ul。

（5）向上清液中加入1/10体积的naac混匀，再加入2倍体积的冰无水乙醇，混匀，—20℃下沉降30分钟。

（6）以12000rpm，离心15min，弃去上清液，得到dna沉淀，为白色。

（7）向dna沉淀中加入70%冰乙醇200ul，不打散沉淀，洗涤。然后以12000rpm离心5min，离心管底部dna沉淀所在面应与收集沉淀面一致。

（8）去掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，室温干燥。用50ulte溶解于1管中。

5、质粒检测

（1）称取0。4g的琼脂糖，置于一锥形瓶中，在三角瓶上标好液面位置，加入40ml的1×tae电泳缓冲液，再加入5—10ml重蒸水，以补充在溶胶过程中损失的水分。然后置微波炉加热至完全溶化，溶液透明。冷却至50℃左右，倒入制板槽制板。

（2）待胶凝固后，小心拔起梳子，使加样孔端置阴极段放进电泳槽内。在槽内加入1×tae 电泳缓冲液，至液面覆盖过胶面2—3cm。取1μl加电泳载样液和3μl质粒样品于小纸片上，用移液枪混匀。

（3）电泳1h，观察溴酚兰的带（蓝色）的移动。

（4） 把胶槽取出，小心滑出胶块，放进eb溶液中进行染色，完全浸泡约5min。

（5）凝胶成像仪观察。

（1）滴加溶液ii时，要逐滴加入，且要轻加轻摇溶液使之混匀，整体动作要快，因为强碱在溶液中停留时间不能过长，否则会破坏质粒dna。

（2）加入溶液iii后，生成了大量的絮状沉淀，溶液iii中和强碱使质粒复性，不可剧烈震荡， 防止染色体dna断裂，应该上下颠倒离心管，使其混匀。