基因工程(jīyīngōngchéng)药物——促红细胞生成素（EPO）第一页，共十八页。EPO的概念EPO的用途EPO的纯化历EPO的销售情及其疗效史及工艺流程情况及其前景第二页，共十八页。EPO：是促红细胞生成素（Erythropoietin）的英文简称。促红细胞生成素：最初是从肾脏中分离出来能刺激前体红细胞增生、分化的一种细胞因子。人体血液中的促红细胞生成素：是由肾脏和肝脏分泌的一种激素样物质，能够促进红细胞生成。它与其受体(EPO-R)结合后共同介导缺氧的生理反应。(fēnmì)第三页，共十八页。医疗用途：增加红血球的数目，用于贫血、组织断离、早产儿，用在癌学和血液学方面。(fùhè)体育用途(兴奋剂)：增加训练耐力和训练负荷，属于国际奥委会规定的违禁药物。2在008年北京奥运会中第一例的兴奋剂。第四页，共十八页。1、肾性贫血患者EPO水平较低，在进行治疗过程中，往往通过注射EPO来提高体内EPO水平进行治疗，从而帮助病人增加红细胞数量，此时EPO水平有所上升。(bāngzhù)2、其他贫血如缺铁性贫血、巨细胞性贫血患者EPO水平不降低，但也可以使用EPO治疗，此时浓度也会有所升高。3、再生障碍性贫血和骨髓造血功能不全患者EPO水平升高。第五页，共十八页。1、Miyake的七步法：纯化步骤太多，对设备及操作要求也较高，不适合工业生产的特点。2、Spivik利用凝集素亲和层析纯化EPO：由于凝集素亲和层析凝胶易被杂蛋白不可逆吸附，使得分离效果降低，成本增高，也不利于大规模生产。3、近年来则利用三步层析法三步纯化基本流程(cénɡxī)等。第六页，共十八页。11、、染染料料配配基基亲亲和和层层析析→→反反相相疏疏水水层层析析→→离离子子交交换换层层析析;;(c(écénɡnɡxīx)ī)((ccéénnɡɡxxīī))(c(écénɡnɡxīx)ī)22、、染染料料配配基基亲亲和和层层析析→→反反相相疏疏水水层层析析→→分分子子筛筛层层析析;;3、反相疏水层析→离子交换层析→分子筛层析。3、反相疏水层析→离子交换层析→分子筛层析。第七页，共十八页。样品浓缩约96.7%样品浓缩约96.7%(nónɡsuō)(nónɡsuō)透析透析第二第步二步：DE：DAEEAE-离离-子子交交换换色色谱谱第三第步三步：分：子分筛子色筛色谱谱总回收率〉30%总回收率〉30%比活1.510U/g蛋白比活1.510U/g蛋白88第八页，共十八页。C6C反6相反柱相（柱（22ccmm22ccmm））（（创创新新生生物物技技术术公司公）司）(jìshù)(jìshù)流程流：程：上样50ml/min（柱结合量约5mg蛋白/m介l质)上样50ml/min（柱结合量约5mg蛋白/ml介质)去离子水平衡至检测基线去离子水平衡至检测基线10%~80%乙醇胍线性梯度洗脱10%~80%乙醇胍线性梯度洗脱检测并收集含EPO主峰检测并收集含EPO主峰ELISA测定ELISA测定结果结：果：洗洗出出EEPPOO60%乙醇-1mol/L盐酸胍60%乙醇-1mol/L盐酸胍第九页，共十八页。透透析析液液：：1100倍倍体体积积的的1100mmmmooll/L/LTTrirsis.H.HCCll透透析析次次数数：：22(cìs(chìsùhù))时时间间：：55~~66hh第十页，共十八页。DDEEAAEE型型离离子子交交换换柱柱流流程程：：1100mmmmooll//LLTTrriiss..HHCCll平平(p(Hp7H7.5.)5)缓缓冲冲液液上上样样202m0ml/lm/miinn（（柱柱结结合合量量2200mmgg//mmll））至至基基线线1100mmmmooll//LLTTrriiss..HHCCll((ppHH77..55))缓缓冲冲液液平平衡衡添添加加NaNCalCl入入缓缓冲冲液液，，进进行行（（NNaaCCll浓浓度度分分别别为为：：5500，，707，0，121525mmmmool/lL/）L）截截状状梯梯度度洗洗脱脱(n(nóónnggddùù))第十一页，共十八页。SeSpephahcaryclSrylS-20-2000流程流：程：上样体积80ml上样体积80ml(tǐjī)(tǐjī)流速2ml/min流速2ml/min流动相20mmol/L柠檬酸-1钠00mmol/LNaC缓冲l液流动相20mmol/L柠檬酸-1钠00mmol/LNaC缓冲l液结果结：果：收集的rHuEPO保留时间约为45min比活性约为1.510U/g蛋白；纯度〉98%（SDS-PAGE检测）收集的rHuEPO保留时间约为45min比活性约为1.510U/g蛋白；纯度〉98%（SDS-PAGE检测）88免疫原性检测：Westernblot免疫原性检测：Westernblot第十二页，共十八页。重组促红细胞生成素，也称超...
