园艺作物病虫害防治(fángzhì)学习(xuéxí)情境1蔬菜病虫害防治子学习情境2:侵染(qīnrǎn)性病害防治第一页，共二十三页。病原真菌(zhēnjūn)的分离与培养一、目的要求掌握病原真菌分离培养的基本原理、学会消毒、灭菌、倒平板、病原真菌的组织分离和稀释分离的基本方法。二、材料、用具和药品新鲜的真菌病害分离材料、PDA的斜面与平板培养基、无菌室、超净工作台或无菌操作(cāozuò)箱（接种箱）、恒温箱、紫外线灭菌灯、酒精灯、火柴、吸管、剪刀、镊子、接种环、接种针、福尔马林、70%乙醇、0.1%升汞、无菌水和记号笔等。第二页，共二十三页。三、内容(nèiróng)与方法分离是将病原物从发病组织上与其他微生物分开；培养是将分离的病原物移到可以让这种病原物正常生长的营养基质（培养基）上，从而获得其纯培养。（一）分离前的准备工作1.工作环境和分离用具的清洁和消毒（1）常用的消毒方法：第三页，共二十三页。常用(chánɡyònɡ)消毒方法及其使用范围方法操作使用范围湿热法常压蒸汽不宜用高压蒸汽灭菌的培辐射法养基化学药品法煮沸玻璃器皿用30W、253.7nm波长的紫外灯无菌室、无菌箱、衣物等照射20-30min.空气及物体表面70%乙醇、2%煤酚皂（来苏水）、无菌室、无菌箱5%石碳酸液等喷雾0.25%新洁尔灭、0.5%次氯酸钙玻璃器皿、金属和木质器（漂白粉）擦拭皿等70%乙醇、0.1%新洁尔灭、0.1%手（不可用升汞），分离升汞浸泡、擦拭材料第四页，共二十三页。（2）清洁和消毒工作环境为了避免污染，分离工作要求在无菌条件下进行，无菌室、超净工作台或无菌操作箱（接种箱）是分离工作不可缺少(quēshǎo)的设施。在分离前，无菌室内用紫外灯照射20-30min，以杀死室内空气中的大多数细菌。无菌操作箱可在分离前用化学消毒剂清除箱内微生物。若分离工作只能在普通房间进行时，必须对房间进行彻底清洁，关闭门窗，避免空气流动，经过喷雾或在地上多洒些水，以除去空气及地面灰尘后进行操作，也可获得较好的结果。工作前擦净桌面，最好铺上湿毛巾自认清洁或纱布上，尽量避免工作过程中临时取物带来污染。工作人员要注意清洁，工作前用肥皂洗手，分离前还要用70%乙醇擦拭双手。第五页，共二十三页。（3）消毒分离用具凡是和分离材料接触的器皿和材料都要保持无菌。将分离用具浸于70%乙醇中，使用时在灯焰上烧去乙醇灭菌，如此3次（刀、剪、镊等不宜烧时过长，以防退火），再次使用时必须重复灭菌。2、选择分离材料分离材料应尽量新鲜，减少腐生菌混入的机会。从受病组织边缘靠近健全组织的部分分离，可减少污染，同时这部分病原生物处于较为(jiàowéi)活跃的状态，生长快，易分离成功。第六页，共二十三页。四、病原真菌的分离方法：（一）组织分离法：1.培养皿准备：取灭菌培养皿一个，置于湿纱布上，在皿盖上注明分离日期、材料和分离人姓名。2.培养皿平板(píngbǎn)制作：无菌操作法向培养皿中加入25%乳酸1-2滴（减少细菌污染），然后将熔化而冷至45℃左右的马铃薯琼脂培养基倒入培养皿中，轻轻摇成平面（分离细菌时则不能加乳酸）。第七页，共二十三页。马铃薯琼脂培养基（PDA培养基）的制作：配方：土豆200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g，水1000mL，pH值自然。（1）称量和熬煮：药品实际用量计算后，按培养基配方逐一称取去皮土豆。土豆切成小块放入锅中，加水1000ml，在加热器上加热至沸腾，维持20－30min，用可用2层纱布趁热在量杯上过滤，滤渣弃取。滤液补充水分到1000ml。（2）加热溶解：把滤液放入锅中，加入葡萄糖20g，琼脂15～20g（提前搞碎），然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，待琼脂完全溶解后，再补充水分至所需量。（3）分装：按实验要求，将配制的培养基分装入试管或500ml三角(sānjiǎo)瓶内。分装时可用三角(sānjiǎo)漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上造成污染。第八页，共二十三页。灭菌与消毒：任何一种培养基一经制成就应及时彻底(chèdǐ)灭菌，以备纯培养用。一般培养基的灭菌采用高压蒸汽灭菌。常用的灭菌的方法有：干热灭菌、高压蒸汽灭菌、常压蒸汽灭菌、常压间歇式灭菌、超高温灭菌、过滤除菌、辐射灭菌、化学...
