菘蓝体细胞染色体加倍的研究（生命科学技术学院生物）摘要：利用秋水仙素结合组织培养技术对菘蓝不同外植体（子叶、下胚轴）进行了胚状体诱导和染色体加倍的研究，实验结果表明：1）子叶是胚状体诱导的最佳材料，且在MS+BAP2.0mg/L+NAA2.0mg/L培养基中获得的胚状体频率最高。2）低浓度秋水仙素短期处理不会影响子叶胚状体的形成频率，但随着秋水仙素浓度的逐渐升高，子叶所形成的胚状体数急剧下降。3）200mg/L秋水仙素处理6d获得的加倍胚状体植株数最多，其加倍频率达到41.1%。4）当秋水仙素浓度高于500mg/L时将对子叶产生毒害作用，不利于胚状体的形成。关键词：崧蓝秋水仙素胚状体染色体加倍菘蓝(IsatisindigoticaFort.)属于十字花科菘蓝属植物,其干燥根医学上称之为板蓝根,具有清热解毒、凉血利咽之功效,医学上用板蓝根治疗伤风感冒、发热、头痛、咽喉肿痛、扁桃体炎、急性腮腺炎、咳嗽痰多等多种上呼吸道感染疾病[1]。利用组织培养技术人工诱导多倍体，是获得新品种的重要途径之一，方法简单，实验条件容易控制，重复性好，处理植株量大，诱导率高，繁殖快。多倍体药用植物一般具有根、茎、叶和花果的巨型性，抗逆性强，药用成分含量高等特性，这正是药材优质、高产育种所期望达到的目标[2]。本研究对菘蓝进行多倍体诱导，从秋水仙碱浓度和处理时间对诱导多倍体的效应及多倍体鉴定等方面进行了研究。1材料、试剂和方法1.1材料以成熟、饱满、品质优良的去夹菘蓝种子做实验的材料。1.2无菌实生苗的获得去夹的崧蓝种子用清水冲洗30～40min，先用75%乙醇浸泡种子1min，再用20%“84消毒液”溶液浸泡种子10min，然后再用40%消毒液溶液浸泡种子10min，最后用无菌水冲洗3～5次。接种于不含任何激素的MS培养基上发芽。1.3确定最佳培养基和最佳外植体将生长旺盛的崧蓝无菌外植体（子叶、下胚轴）分别剪成约0.3cm2的小块和0.5cm的小段并分别接种于以下含不同浓度激素的MS培养基中，每种浓度5个重复。CK：MS+BAP0.1mg/L+NAA0.1mg/L；1号：MS+BAP2.0mg/L+NAA0.2mg/L；2号：MS+BAP2.0mg/L+NAA2.0mg/L；3号：MS+BAP1.0mg/L+NAA1.0mg/L；4号：MS+BAP1.0mg/L+2,4-D1.0mg/L；5号：MS+BAP2.0mg/L+2,4-D2.0mg/L。在25℃、不间断光照下进行愈伤组织的诱导及分化培养。并观察记录不同外植体形成愈伤组织频率以及愈伤组织生长状态[3]。1.4确定崧蓝子叶加倍的秋水仙素浓度和处理时间将生长旺盛的崧蓝无菌苗子叶去叶缘剪成0.3cm2小块分别接种于含不同浓度秋水仙素的最佳（2号）培养基中，分别以3d、6d、9d、15d、20d为处理时间变量，每个浓度10个重复，每瓶处理接入10个外植体，进行愈伤组织的诱导分化，秋水仙素处理3d、6d、9d、15d、20d时将正在培养的生长较好的外植体从培养基中取出，移入不含秋水仙素MS+BAP2.0mg/L+NAA2.0mg/L的培养基中继续培养。观察统计出不同秋水仙素浓度以及不同处理时间下愈伤组织生长状态[4]。培养基中激素配比及浓度如下：A号：MS+50mg/L+BAP2.0mg/L+NAA2.0mg/L；B号：MS+100mg/L+BAP2.0mg/L+NAA2.0mg/L；C号：MS+200mg/L+BAP2.0mg/L+NAA2.0mg/L；D号：MS+500mg/L+BAP2.0mg/L+NAA2.0mg/L。1.5不定苗的生根、染液配制及染色体倍性确定不定苗的生根将长势良好的胚状体分离接入生根培养基（MS+IBA0.4mg/L）中培养，25℃不间断光照，观察诱导生根情况，待根长至1cm左右时进行根尖染色体倍性检查。染液配制取3g碱性品红溶于100ml70%酒精中（可长期保存）配制成A液，B液:取10mlA液加入90ml5%的碳酸酚（苯酚）水溶液中，两周内使用。C液：取55mlB液加6ml冰醋酸及6ml福尔马林。D液：取C液20-30ml加70-80ml45%冰醋酸和1.8g山梨醇，两周后使用。染色体倍性确定撕取不定芽叶片下表皮检查气孔保卫细胞中叶绿体个数。切取根尖于卡诺固定液中固定1d，弃固定液后用水冲洗，然后加1NHCl并于60℃水浴锅中水浴8～10min，切取根尖放于载玻片上，滴加染液后压片观察计数细胞分裂中期染色体数目[5]。1结果与分析2.1崧蓝胚状体的形成培养3～4天后，多数子叶开始膨大，无愈伤现象，但可观察到少量胚状体（图1）。而下胚轴两端膨大，并无胚状体产生。随着培养时间的延长，子叶产生更多胚状体，但在4...
